ریزپوشانی میکروارگانیسم های پروبیوتیک

امروزه گرایش زیادی به مصرف موادغذایی فراویژه یعنی غذاهای دارای ارزش دارویی و تغذیه ای ویژه علاوه بر خواص تغذیه ای پایه، بوجود آمده است. پروبیوتیک ها، پری بیوتیک ها و سین بیوتیک ها و محصولات غنی شده تغذیه ای، همگی از جمله این مواد غذایی هستند. در نتیجۀ مصرف مواد غذایی فراویژه ، جمعیت میکروبهای ساکن روده از تعادل بهتری برخوردار می شود که به موجب آن سلامت بیشتر را برای مصرف کنندگان به دنبال دارد. مصرف فرآورده های پروبیوتیک از روش های مناسب و مؤثر تنظیم فلور میکروبی روده است. در حال حاضر بیش از 75 فرآورده لبنی محتوی پروبیوتیک ها در سراسر جهان تولید می شود و نیز تلاش برای استفاده از ترکیبات پری بیوتیک در کنار پروبیوتیک ها آغاز شده است. در فرآورده های پروبیوتیک، شاخص های قابلیت زیستی ، خواص حسی و مدت زمان تخمیر از فاکتورهای اساسی کیفی این فرآورده ها و یا دشواری های تولید آنها به شمار می آیند . قابلیت زیستی پروبیوتیک ها در فرآورده های غذایی در درجه اول اهمیت قرار دارد.در ادامه به طور خلاصه به فاکتورهای موثر در قابلیت بقا و ریزپوشانی پروبیوتیک ها پرداخته می شود.

- تعریف پروبیوتیک:

کلمه پروبیوتیک از واژه یونانی پروبیوس به معنای حیات بخش گرفته شده و متضاد کلمه پادزیست به مفهوم ضد حیات است. پروبیوتیک ها میکروارگانیسم های زنده ای هستند که در مقادیر کافی اثرات بسیار مثبتی روی سلامت میزبان دارند. به عبارتی پروبیوتیک ها ارگانیسم ها یا مواد حاملی هستند که تعادل میکروبی روده را بهبود می بخشند و شامل گونه های لاکتوباسیلوس، بیفیدوباکتریوم، پروتئین های بیواکتیو نظیر ایمونوگلوبولین A و لاکتوفرین می باشند. گونه های لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس[1]، لاکتوباسیلوس کازئی[2]، بیفیدوباکتریوم بیفیدوم[3]، بیفیدوباکتریوم لانگوم[4] و بیفیدوباکتریوم بروی[5] از مهمترین باکتری های پروبیوتیک می باشند.

بهترین تعریف برای پروبیوتیک هایی که به مصرف تغذیه انسان می رسند عبارت است از اجزاء غذایی میکروبی زنده که اثرات سودبخش بر سلامت میزبان دارند. علاوه بر لاکتوباسیل ها و بیفیدوباکتریوم ها، مخمرهایی مانند ساکارمیسس بولاردی[6] و برخی از سویه های اشرشیاکلی جزء میکروارگانیسم های پروبیوتیک محسوب می شوند .

از مزایای مهم پروبیوتیک ها می توان به خاصیت ضد میکروبی، کاهش عدم تحمل لاکتوز، کاهش سطح کلسترول سرم خون، فعالیت ضدجهشی و ضد سرطانی و نیز تحریک سیستم ایمنی اشاره کرد.

2- قابلیت زیستی پروبیوتیک ها

ارزش زیستی فرآورده در لحظه مصرف وابسته به دو عامل است:

الف- تعداد اولیه پروبیوتیک ها پیش از مرحله نگهداری یخچالی که خود به عواملی نظیر حجم تلقیح، میزان تکثیر در مرحله تخمیر و میزان مرگ و میر طی تولید بستگی دارد و ب- قابلیت بقای پروبیوتیک ها در دوران نگهداری یخچالی .

تعداد سلول های زنده پروبیوتیک در گرم یا میلی لیتر در لحظه مصرف «ارزش زیستی[7]» و حداقل ارزش زیستی لازم برای برخورداری از خواص سلامت بخشی و دارویی پروبیوتیک ها را «ارزش دارویی» می نامند. در فرآورده های پروبیوتیک سرعت تخمیر کم و زمان گرمخانه گذاری زیاد است. دلیل آن را باید در کم بودن عوامل رشد مورد نیاز در محیط شیر جستجو کرد .

بررسی های مختلف نشان داده است که باکتری های پروبیوتیک بویژه بیفیدوباکتریوم ها رشد ضعیفی در شیر دارند. محیط بی هوازی، با پتانسیل احیاء پایین و وجود فاکتورهای بیفیدوژنیک برای رشد مطلوب این باکتری ها لازم است .

بقاء باکتری های پروبیوتیک در شیرهای تخمیری پروبیوتیک وابسته به فاکتورهایی نظیر گونه مورد استفاده، واکنش بین گونه های موجود، شرایط کشت، ترکیب شیمیایی محیط کشت تخمیری (مثلاً کربوهیدرات)، اسیدیته نهایی، مواد جامد شیر، مواد مغذی موجود، اکسیژن محلول (بویژه برای بیفیدوباکتریوم)، سطوح تلقیح و درجه حرارت آن، زمان تخمیر و درجه حرارت نگهداری وابسته است . برخی محققین بیان داشتند که باکتری های پروبیوتیک در ماست های تجاری طی 35 روز نگهداری به اندازه 3 سیکل لگاریتمی کاهش می یابند .

3- ریزپوشانی[8] پروبیوتیک ها:

قابلیت زیستی اندک پروبیوتیک ها در شرایط دشوار فرآورده های غذایی و شرایط اسیدی و صفراوی دستگاه گوارش موجب پیدایش روش نوینی به نام ریزپوشانی گردید. ریزپوشانی عبارت است از پوشش دادن لایه ای از هیدروکلوئیدها به دور سلول های میکروارگانیسم های پروبیوتیک و محصور کردن[9] آنها به منظور تفکیک از محیط طوری که آزادسازی هدفمند سلول ها در مکان و زمان مناسب را به دنبال داشته باشد .

از عوامل آزادسازی[10] در این مورد می توان به گرما، سرما، تغییرات pH، وجود اکسیژن مولکولی، حضور مواد شیمیایی مختلف و زمان اشاره کرد. ریزپوشانی سلول ها از محیط به ایمن سازی آنها از شرایط شدید محیطی نظیر pH پایین و یا اسیدیته بالا، انجماد شدید[11] یا خشک کردن انجمادی[12]، اکسیژن مولکولی، خشک کردن پاششی، باکتریوفاژها، ترکیبات شیمیایی ضد میکروبی صورت می گیرد .

3-1-ساختار و اجزای ریزپوشانه ها:

ریزپوشانه ای که از پوشش یافتن لایه ای از ریزپوشینه بر سطح سلول یا سلول ها پدید می آید، دانک[13] نامیده می شود. حال اگر ریزپوشینه ساختار ژل داشته باشد به آن ژل دانک[14] می گویند. به دلیل شکل هندسی دانک ها (کروی تا بیضوی) در برخی مواقع به آن ها ریز کره[15] اطلاق می شود. لایه دوم پوشش داده شده ریزپوشانه های دانکی پوستین، غلاف یا حفاظ نام دارد .

3-2 ترکیبات مورد استفاده در ریزپوشانی:

در این بخش مهمترین ترکیبات مورد استفاده در فرایند ریزپوشانی پروبیوتیک ها بررسی می شوند:

3-2-1- نشاسته:

نشاسته در بسیاری از موارد در ترکیب با آلژینات بکار می رود. از نشاسته ذرت آمیلوز بالا (HACS)[16] و نشاسته ذرت لیوفلیزه (LCS)[17] به ترتیب در ساخت پوستین و پوشینه استفاده می شود. نشاسته مقاوم (RS)[18] با آنزیم آمیلاز موجود در لوزالمعده شکسته نشده و مستقیماً به روده بزرگ می رود. تخمیر نشاسته با باکتری های پروبیوتیک به دلیل تولید اسیدهای چرب زنجیره کوتاه، pH روده را کاهش می دهد.همچنین گزارش شده که چسبندگی باکتری ها به نشاسته ممکن است مزایایی را از جهت حمل پروبیوتیک ها به دستگاه گوارش و بهبود قابلیت زیستی آنها به دنبال داشته باشد.

3-2-2- آلژینات و ترکیبات آن:

آلژینات یک پلی ساکارید خطی و ناهمگن و با واحدهای سازنده D-مانورونیک و L-گلورونیک اسید است. آلژینات کلسیم به طور گسترده در ریزپوشانی باکتری های لاکتیک و پروبیوتیک ها در غلظت های 4-5/0% بکار می رود.

ریزپوشانی پروبیوتیک ها با آلژینات دارای مزایای متعددی است که مهمترین آنها تشکیل شبکه ژل حول غشای باکتری ها، عدم اثرات سمی روی سلول یا بدن، قیمت ارزان و سهولت تهیه در شرایط آزمایشگاهی می باشد .

در مقابل معایبی نیز دارد که شامل عدم مقاومت به اسید و ایجاد چروک در محیط های حاوی اسید لاکتیک می باشد. مخلوط کردن آلژینات کلسیم با نشاسته ذرت بالا از یک سو پوشینه ای یکنواخت پدید می آورد و از سوی دیگر بقای سلول ها را هم به دلیل یاد شده و هم به سبب برخوردار بودن از خاصیت پری بیوتیکی افزایش می دهد.

3-2-3- ژلاتین[19]:

صمغ ژلاتین جهت کپسوله کردن پروبیوتیک ها به تنهایی یا در مخلوط با دیگر صمغ ها بکار می رود. ژلاتین صمغی پروتئینی است که ژل برگشت پذیر گرمایی ایجاد می کند). برخی محققین گزارش نمودند که مخلوط ژلاتین و صمغ عربی در پوستین سازی پوشینه های روغن سویا بکار می رود.

3-2-4- کاراگینان و مخلوط های آن:

K-کاراگینان[20] پلیمری پلی ساکاریدی و خنثی است. این ترکیب در غلظت های بالا (5-2%) به دماهای بالا (C°90-60) جهت حل شدن نیاز دارد. مخلوط K-کاراگینان لوبیای خرنوب[21] در مقایسه با آلژینات، در محصولات تخمیری شیری نظیر ماست کارایی بهتری دارد زیرا حساسیت آنها به اسید کم تر است. ترکیب مذکور به میزان گسترده ای در ریزپوشانی پروبیوتیک ها در فرآورده های تخمیری بکار می رود.

3-2-5- کیتوزان[22]:

کیتوزان پلی ساکارید خطی با بار مثبت است این ترکیب به تنهایی قادر به حفظ قابلیت زیستی پروبیوتیک ها نبوده و لذا بیشتر به عنوان پوستین یا غلاف (مثلاً در پوستین سازی پوشینه های ژلاتین) بکار می رود تا پوشینه. عده ای از محققین گزارش نمودند که به جهت دستیابی به پایداری بیشتر، دانک های کیتوزان می توانند درحضور آنیون هایی نظیر پلی فسفات ها و یا آلژینات سدیم ایجاد اتصالات عرضی کنند و به یکدیگر متصل شوند .

همچنین برخی محققین بقاء پروبیوتیک های ریزپوشانی شده با کیتوزان را در ماست و در شیر UHT در طول نگهداری ارزیابی کرده و به این نتیجه رسیدند که بقاء باکتری های پروبیوتیک لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس 547، لاکتوباسیلوس کازئی 01 و بیفیدوباکتریوم بیفیدوم 1994 حدود یک لگاریتم نسبت به سلول های آزاد بیشتر است .

3-2-6- مخلوط ژلان-زانتان:

مخلوط صمغ های زانتان و ژلان به صورت درصد بهینه اختلاط 1: 75/0 برای ریزپوشانی پروبیوتیک ها بکار برده شده است. این مخلوط برخلاف آلژینات به شرایط اسیدی مقاوم می باشد.

.3-2-7- سلولز-استات-فتالات [23](CAP):

این ترکیب دارای گروه های یونی باردار فتالات است. در محیط های با 5>pH حل نشده ولی در 6[24] خشک شده انجمادی استفاده شده که نتیجه آن گذر کامل باکتریها به تعداد بالا از شیره معده بوده است.

4- مزایای ریزپوشانی پروبیوتیک ها:

از مزایای ریزپوشانی باکتری های پروبیوتیک ها می توان به موارد مهم زیر اشاره کرد:

1-افزایش قابلیت بقای پروبیوتیک ها طی تهیه کشت های آغازگر.

2-حفاظت سلول های پروبیوتیک در مقابل باکتریوفاژها.

3-افزایش بقاء در طول انجماد و خشک کردن.

4-افزایش بقاء پروبیوتیک ها طی گذر از شرایط اسیدی – آنزیمی – صفراوی معده، لوزالعمده و روده کوچک.

5-بهبود خواص حسی فرآورده های پروبیوتیک.

5-روش های ریزپوشانی پروبیوتیک ها:

روش های ریزپوشانی پروبیوتیک ها در کل به دو دسته روش امولسیون[25] (روش دو مرحله ای[26]) و روش روزن رانی (اکستروژن[27] یا قطرکی[28]) تقسیم می شوند.

5-1-روش امولسیون:

روش امولسیون به طور موفقیت آمیزی در ریزپوشانی باکتری های اسید لاکتیک بکار می رود. این روش به مراتب ساده تر بوده ولی به دلیل استفاده از روغن گیاهی برای ساخت امولسیون نسبت به روش اکستروژن هزینه بالاتری را می طلبد. در این روش، حجم کمی از شفته[29] سلول یا پلیمر (به عنوان فاز پراکنده) به حجم زیادی از روغن گیاهی (به عنوان فاز پیوسته یا فراگیر) مانند روغن سویا، ذرت، آفتابگردان اضافه می شود. در ادامه مخلوط حاصل از طریق هم زن به خوبی همگن می شود تا امولسیون w/o بدست آید. قطر دانک ها در این روش کمتر (mm2-mm25) است.

اندازه دانک ها علاوه بر اثر روی قابلیت بقاء پروبیوتیک ها و میزان فعالیت متابولیک آنها، روی خواص بافتی و دهانی محصول نهایی، چگونگی توزیع، پراکنش و امولسیون شدگی آنها پس از تلقیح در فرآورده مؤثر است.

5-2- روش اکستروژن:

روش اکستروژن در مورد پوشینه آلژینات شامل مراحل زیر است: تهیه محلول هیدروکلوئیدی[30]، افزودن سلول های پروبیوتیک به آن و ایجاد معلقه سلولی[31]، روزن رانی آن از خلال محلول سوزن سرنگ[32] به شکل قطرک به نحوی که قطرک های ایجاد شده مستقیماً به داخل محلول سفت کننده[33] یا محفظه بستن[34] چکه کنند. محلول یاد شده حاوی کاتیون های چند ظرفیتی است. آلژینات موجود در محلول به سرعت سلول های افزوده شده را محصور کرده و شبکه ای سه بعدی از این هیدروکلوئید به کمک پیوندهای عرضی کلسیم تشکیل می شود .

جدول 2-1- تکنیک ها و روش های مورد استفاده برای کپسوله کردن میکروارگانیسم های پروبیوتیک

تکنیک های میکروکپسوله کردن	انواع مواد برای پوشش	مراحل عمده در فرآیند
خشک کردن پاششی	پلیمرهای محلول در آب	1-آماده سازی محلول های حاوی میکروارگانیسم ها 2- اتمیزه کردن مواد مورد نظر به صورت پاششی 3- خشک کردن مواد (تبخیر رطوبت) 4- جداسازی محصول خشک شدن
انجماد پاششی	موم ها، اسیدهای چرب، پلیمرهای محلول و نامحلول در آب، مونومرها	1-آماده سازی محلول های محتوی هسته (مثل پروبیوتیک ها) 2- جامدسازی پوشش با انجماد مواد پوششی ذوب شده به درون غیر حلال 3- حذف مواد غیر حلال با Sorption، تکنیک های استخراج یا تبخیر
پوشش بسترسیال/ سوسپانسیون هوا	پلیمرهای محلول و نامحلول در آب، چربی ها، موم ها	1-آماده سازی محلول های پوششی 2- سیال سازی ذرات هسته 3- پوشش ذرات هسته با محلول پوششی
اکستروژن	پلیمرهای محلول و نامحلول در آب	1-آماده سازی مواد محلول پوششی 2-پخش مواد هسته 3-خنک کردن یا عبور مخلوط پوشش – هسته از مایع دهیدراته
تکنیک جداسازی فاز	پلیمرهای محلول در آب	1-مواد هسته در یک محلول پلیمر پوششی حل شده، حلال برای پلیمر به عنوان یک فاز حامل مایع می باشد 2-Deposition پوشش، مخلوط فیزیکی پوشش و مواد هسته ای در فاز حامل 3- سخت کردن پوشش با حرارت، تکنیک های desolvation یا ایجاد پیوندهای عرضی، به شکل میکروکپسول های نگهداری شده
روش الکترواستاتیک	پلیمرهای / ترکیبات باردار	1-مخلوط کردن هسته و مواد پوششی 2-الکتروژن مخلوط مواد پوششی – هسته در محلول های opp 3-خشک کردن پاششی یا خشک کردن با آون میکروکپسول ها، ریز – کره ها یا دانک ها

با توجه به گستردگی و تنوع محصولات پروبیوتیک و موفقیت های بدست آمده در بکارگیری ریزپوشانی پروبیوتیک ها ، لزوم انجام مطالعات بیشتر ضروری به نظر می رسد.

6- فهرست منابع:

1-   پوراحمد، ر. و فدایی، و . 1386، فرآوری شیر، انتشارات مرز دانش، تهران.

2-   خسروی دارانی، ک. و کوشکی، م. 1387. پروبیوتیک ها در شیر و فرآورده های آن، انتشارات مرز دانش، تهران.

3- طاهری، پ.، احسانی، م. ر. و خسروی دارانی، ک. 1388. تأثیر باکتری پروبیوتیک لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس La-5 بر ویژگی های میکروبیولوژیک، خواص حسی و پایداری بافتی دوغ پروبیوتیک طی نگهداری یخچالی، مجله علوم تغذیه و صنایع غذایی ایران، سال چهارم، شماره (3).

4-       مرتضویان، ا. م. و سهراب وندی، س. 1385، مروری بر پروبیوتیک ها و فرآورده های غذایی پروبیوتیک، انتشارات اتا، تهران.

5-           Alizadeh, A. and Ehsani, M. R. 2008. Probiotic survival in yogurt made from ultrafiltered skim milk during refrigeration storage. Research Journal of Biological Sciences, 3, 1163-1165.

6-           Al-Otaibi, M. M. 2009. Evaluation of some probiotic fermented milk products from Al-Ahsa market, Saudi Arabia. American Journal of Food Technology, 4, (1), 1-8.

7-           Anal, A. K. and Singh, H. 2007. Recent advanced in microencapsulation of probiotic for industrial applications and targeted delivery. Trends in Food Science and Technology, 18, 240-251.

9-           AOAC. 2002. Official methods of analysis of the AOAC, 15th,ed. (Ed.S.Williams). Arlington, USA: Association of Official Analytical Chemists.

10-       Bari, M., Ashrafi, R., Alizadeh, M. and Rofehgarineghad, L. 2009. Effects of different of yogurt starter or probiotic bacteria, storage time and different concentration of cysteine on the microflora characteristics of Bio – Yogurt. Research Journal of Biological Sciences, 4, (2), 137-142.

11-       Brunetti, J. 2007. The link between nutrition and agriculture, USDA Human Nutrition Center, 1-138.

12-       Calleros, C. L., Cruz – Hernandez, M.,  Castillo – Zambrano, C., Sandoval – Castilla, O., Martinez – Romero, S., Hornelas – Orozco, Y. and Vernon – Carter, E. J. 2007. Microencapsulation of Lactobacillus casei 81 Lyo using sodium alginate blended with amidated low – methoxyl pectin or modified starch as well materials, Viability in yogurt. Acta Microscopic, 16, (2), 250-251.

13-       Crittenden, R., Laitila, A., Forssell, P., Matto, J., Saarela, M. and Mattila-Sandholm, T.2001. Adhesion of Bifidobacteria  to granular starch and its implications in probiotic technologies. Applied and Environmental Microbiology, 67, 3469-3475.

14-       Guarner, F. 2008. Probiotic and prebiotic world Gastroenterology Organisation Practice Guideline, 1-22.