محیطهای کشت آزمایشگاه مواد غذایی

محیط های کشت باکتریها به سه صورت زیر تهیه میشود :

محیط کشت مایع یا آبگوشتی (liquid or broth media)
محیط کشت جامد (solid media)
محیط کشت نیمه جامد (semi solid media


محیط کشت مایع ( براث ) :

این محیط فاقد آگار و فقط در لوله آزمایش یا فلاسک استفاده میشود . مثل محیط نوترینت براث.



محیط کشت جامد :

این محیط حاوی 5/1 تا 2 درصد ماده آگار است که بعد از سرد شدن منعقد می شود . محیط کشت جامد را درون لوله آزمایش یا پلیت استفاده می کنند.مثل محیط TSI و M.c



دلیل بکارگیری محیط جامد ، تشخیص باکتریها به وسیله :

تشکیل کلنی
تولید پیگمانت
خصوصیات خاص هر کلنی
تشخیص انواع باکتریها که چند نوع باکتری در نمونه میکروبی وجود دارد .
موکوئیدی بودن باکتری
دیدن منطقه همولیز .


محیط کشت نیمه جامد :

این محیط در ترکیب خود مقدار کمی آگار دارد . بنابراین کاملا منعقد نمی شود و نیمه جامد باقی می ماند . مثل محیط SIM .

آگار :

ماده ای پلی ساکاریدی است که از یک نوع جلبک قرمز دریایی تهیه می شود، در c° 95 ذوب و در حرارت c° 42 منعقد می گردد .


محیط های کشت باکتری را از نظر نوع مواد تشکیل دهنده و از نظر کاربرد به چهار دسته تقسیم می کنند:

محیط کشت پایه (Basic Media) :

این محیط کمترین مقدار مواد غذایی برای رشد باکتریها را دارد . و مبنای تهیه انواع و اقسام محیطهای کشت می باشد . اکثر انواع باکتریها در آن رشد می کنند زیرا فاقد ماده ضد میکرب است . مانند محیط نوترینت آگار ، نوترینت براث .

محیط کشت غنی کننده (Enrichment Media) :


محیط مقوی بوده که دارای مواد تغذیه ای زیادی نظیر ویتامین ها ، لیپید ها ، اسید های آمینه برای رشد باکتری است . بنابراین تعداد زیادی از باکتریها روی آن بخوبی رشد می کنند . مانند شکلات آگار، بلادآگار .

محیط کشت افتراقی (Differential Media) :

محیط کشت تشخیصی بوده که کلنی باکتریهای مختلف روی آن کاملا از همدیگر متمایز می گردد. مانند محیط E.M.B ، M.c این محیطها دارای املاح صفراوی ، قند و معرف شیمیایی هستند که باکتریهای لاکتوز مثبت برروی آنها کلنی های صورتی رنگ و باکتریهای لاکتوز منفی نظیر سالمونلا ، شیگلا بر روی این محیط ها کلنی های سفید رنگ تشکیل می دهند . از محیطهای افتراقی دیگر محیط TSI ، سیمون سیترات را میتوان نام برد . این محیط ها برای رشد باکتریهای گرم – منفی روده ای (انتروباکتریاسه) مناسب هستند . چون وجود املاح صفراوی در محیط مانع از رشد باکتریهای گرم مثبت در محیط می شوند.

محیط کشت اختصاصی (Special Media) :

این محیطها برای رشد باکتریهای خاصی مناسبند . از این محیطها برای ایزوله نوع خاصی از باکتری در یک مخلوط میکربی استفاده می شود . مانند محیط s.s آگار که برای جدا کردن سالمونلا و شیگلا بکار میرود یا مانیتول سالت آگار که برای تشخیص گونه بیماریزای استافیلوکوکوس اورئوس استفاده می شود .

محیط کشت انتخابی : (Selective Media )

محیط هایی وجود دارند که دارای یک ماده مهار کننده رشد می باشند این مواد رشد تمام ارگانیسم ها بجز ارگانیسم مورد نظر را مهارمی کنند . درمرحله اول از رنگ هایی که دارای خواص ضد میکروبی هستند استفاده می شود ودر مرحله بعد استفاده از آنتی بیوتیک ها و مرحله آخر شامل وارد کردن مواد ترکیبی به محیط کشت جهت فعالیتهای متابولیکی ارگانیسم مورد نظر می باشد . از آنجا ئیکه این محیط ها جهت ارگانیسم مورد نظر انتخاب شده اند و برای سایر ارگانیسم ها مضر می باشند آنها را محیط های انتخابی می نامند . مثالی از این نوع محیط ها ، محیط کشت فنیل اتیل الکل آگار است که از رشد باسیل های گرم منفی هوازی و بی هوازی اختیاری ممانعت بعمل آورده و به ارگانیسم های گرم مثبت اجازه رشد می دهد .



طرز تهیه کلی محیط های کشت :


همانطوریکه می دانید محیطهای کشت به سه دسته جامد ، نیمه جامد ، مایع تقسیم می شوند . محیطهای مایع معمولاً فاقد آگار هستند یا مقدار آگارشان بسیار کم است . مثلاً حدود ( 2/0%) و محیط های نیمه جامد دارای مقدار کمی آگار حدود 3- 2 گرم وبالاخره محیط های جامد که دارای 15- 13 گرم آگار در لیتر محیط هستند .

برای ساختن محیط های کشت باکتری، ما از پودر مخصوص که در شیشه های مربوطه قرار دارد، استفاده می‌ کنیم. در روی این شیشه ها ترکیب محیط بطور کامل و همچنین طرز ساختن آن نوشته شده است . مثلاً برای ساختن نوترینت آگار ابتدا مقدار لازم از پودر آن را وزن کرده ودر مقدار معینی آب مقطر که قبلاً در یک ارلن مایر یا بطری ریخته اید اضافی نموده و آنرا کاملاً‌ حل نمائید وسپس با پنبه درب ارلن مایر را مسدود کرده و آن را روی سه پایه چراغ گازی حرارت می‌دهید ، تا زمان جوشیدن آنرا چند بار تکان دهید تا خوب حل شود و بمدت یک دقیقه بجوشد پس از آنکه مایع بجوش آمد ، آنرا برداشته وبا تکه کاغذ آلومینیومی روی پنبه را می‌پوشانید وظرف را در اتوکلاو می‌گذارید تا در فشار 15 پاند بر اینچ مربع و حرارت 121 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه استریل شود . بعد از استریل کردن بگذارید تا خنک شود تا حدود c450- 40 . سپس در حالیکه ارلن را در دست راست گرفته و پنبه آنرا با دست چپ کنار شعله خارج کرده‌اید ، دهانه ارلن را یکبار از درون شعله گاز عبور دهید وبعد درون پلیت های استریل شده بین cc20- 15 از محل محلول بریزید . بعد پلیت ها را در کناری بگذارید تا سرد شوند وازتکان دادن آن خودداری نمائید وپس از جامد شدن محیطهای کشت نوترینت آگار را جمع کرده ودر c370 بمدت 24 ساعت قرار دهید . اگر محیط ها آلوده نشده باشند آنها را از c370 بیرون آورده و در یخچال 4 درجه سانتی گراد قرار می‌دهید .

طرز ساختن سایر محیطهای کشت، همینطور می‌باشد منتهی بعضی از محیطهای جامد در لوله مستقیم، پس از جوشاندن ریخته شده و بعد استریل می‌شوند که این محیطها را پس از استریل شدن، به طور ایستاده می‌گذاریم مثل محیط SIM و یا کج می‌گذاریم مثل محیط TSI تا سرد شوند .

برای ساختن محیط مایع (براث) پس از جوشاندن، محیط را در لوله‌ ها تقسیم می‌کنیم و سپس با پنبه‌ای درب آنها را مسدود کرده و جهت استریل داخل اتوکلاو قرار می‌دهیم .


انواع محیط های کشت

محیط های کشت عمده ‌ای که در آزمایشگاه مورد استفاده قرار می‌گیرند عبارتند از :

محیط نوترینت براث (Nutrient broth ):

این محیط مبنای ساخت اکثر محیطهای کشت است و از عصاره گوشت تهیه می‌شود طرز تهیه آن مثل نوترینت آگار می‌باشد . این محیط بدلیل نداشتن آگار بصورت مایع در لوله آزمایش تهیه می شود .



محیط نوترینت آگار (Nutrient agar):

چنانچه ماده آگار را به نسبت 5/1 تا 2 درصد با آبگوشت غذایی مخلوط کنیم، این آگار غذایی بدست می‌آید . این محیط مبنای تهیه انواع و اقسام محیط های کشت جامد مثل Blood Agar , Chocolate agar می باشد .



محیط آگار خوندار (Blood agar) :

اغلب نمونه های رسیده به آزمایشگاه میکروب شناسی بر روی محیط آگار خوندار کشت داده می‌شوند، چون این محیط از رشد تمام واغلب باکتریهای سخت رشد حمایت کرده و اغلب میکروب شناسان عادت دارند بر اساس مورفولوژی کلنی بر روی آگار خوندار تصمیم گیری نمایند . این محیط از یک محیط پایه مانند تریپتون که منشاء پروتئینی دارد، کلرید سدیم آگار و 5 درصد خون تشکیل شده است . برخی باکتریها آنزیم های خارج سلولی تولیدکرده که بر روی گلبول‌های قرمز عمل کرده و آنها راکاملاً لیز می‌کند (همولیزبتا ) یا یک تغییر سبز رنگ در اطراف کلنی ایجاد می‌کند ( همولیز ناقص یا آلفا ) در صورتی که برخی از باکتریها تغییری ایجاد نمی‌کنند ( همولیزگاما) تولید همولیزین بوسیله باکتری به بسیاری از فاکتورهای محیطی مانند PH ، اکسیژن و دما بستگی دارد. میکروب شناسان اغلب از مورفولوژی کلنی و تولید همولیزین به عنوان آزمایشات غربالگری اولیه جهت کمک به تصمیم در انتخاب مراحل دیگر جهت شناسایی یک باکتری استفاده می‌کنند. جهت مطالعه درست واکنش همولیتیک بر روی آگار خوندار، کارشناس بایستی پلیت را در مقابل نور گرفته و مشاهده نماید. اگر از لوپ جهت کشت خطی بر روی آگار خوندار استفاده می‌شود باید آنرا در آگار فرو برده ( Stabbing) تا ارگانیسم بتواند در زیر سطح محیط که اکسیژن کمتری دارد رشدکند . تولید همولیزین های حساس به اکسیژن در برخی از ارگانیسم ها بدین وسیله تشدید می‌گردد . به روش دیگر، می‌توان پلیت‌ها را جهت مشاهده واکنش همولیزین حساس به اکسیژن به طریق بی هوازی نیز انکوبه نمود


طرز تهیه انواع محیط های کشت

:

1- ابتدا مقداری آب مقطر در داخل یک ارلن ریخته پودر نوترینت آگار را به آن اضافه و حل نمائید .

2- محتویات ارلن را با آب مقطر به حجم برسانید .

3- محتویات ارلن را روی شعله حرارت دهید تا بجوشد و محیط شفاف شود .

4- محیط کشت را توسط اتوکلاو 15 دقیقه درحرارت c 1210 استریل کنید .

5- پس از استریل کردن، بگذارید تا حرارت محیط کشت به 0c50- 45 برسد آنگاه در شرایط استریل ودر مجاورت شعله ، با توجه به حجم محیط ساخته شده، 10ـ 5 درصد خون گوسفند به آن اضافه نموده و خوب بهم بزنید تا کاملاً مخلوط شود .

6- محیط را در مجاورت شعله داخل پتری دیش های استریل بریزید .

7- پس از پخش محیط در داخل پلیت ها چنانچه در سطح آنها حبابهای هوا تشکیل شود، بااستفاده از شعله حبابها را از بین ببرید .

8- ضخامت لایه آگار داخل پلیت ها نباید از 4-3 میلی متر تجاوز کند .

9- پس از آماده و منجمد شدن محیط های ساخته شده، پلیت ها را به مدت 24 ساعت در حرارت c370 انکوبه کنید . رشد باکتری بر روی این محیطهای کنترل ، نمایانگر آلوده بودن محیط ها است . بنابراین از این محیطهای آلوده نباید استفاده کرد .

محیط بلاد آگار در داخل یخچال به مدت یک هفته پایدار است و چنانچه بنحوی از تبخیر آب آن جلوگیری شود، پایداری آن بیشتر می‌شود .


محیط شکلات آگار(Chocolate agar):


در ساختن این محیط از محیط آگار استفاده می شود . پس از آماده نمودن و استریل کردن محیط پایه ، خون را هنگامی که هنوز داغ است ( در حدود 0c85 ) به آن اضافه می کنیم .گلبولهای قرمز در این حالت لیز شده و محیط رنگ شکلاتی ـ قهوه ای به خود می‌گیرد . اکنون هموگلوبین و سایر مواد مغذی موجود در گلبولهای قرمز درمحیط وجود دارند . همین ( Hemin ) که فاکتور x خوانده می شود و کوآنزیم نیکوتین آدنین دی نوکلئوتید (NAD) که فاکتور V خوانده می‌شود ، به عنوان مکمل به محیط پایه آگار غنی از مواد مغذی اضافه می‌گردند . نایسریا گونوروه و گونه‌های هموفیلوس در میان سایر ارگانیسم های سخت رشد، رشد بهتری درحضور مواد مغذی مکمل اضافه شده به شکلات آگار دارند .


محیط ائوزین متیلن بلو (E.M.B) :


یک محیط افتراقی در بردارنده لاکتوز با پپتون وائوزین متیلن بلو است . رنگهای انیلینی موجود در محیط ( ائوزین ، متیلن بلو ) مانع از رشد باکتریهای گرم ـ مثبت می شوند .

این رنگها همچنین در PH اسیدی باهم ترکیب شده وایجاد رسوب می نمایند . بنابراین می توان از وجود آنها بعنوان شاخصی جهت تخمیر لاکتوز و تولید اسید نیز استفاده نمود .

باکتریها گرم ـ منفی بر اساس تخمیر یا عدم تخمیر قند لاکتوز کلنی های صورتی و یا بی رنگ تشکیل می دهند .

باکتری اشرشیا کلی ( E.coli ) که لاکتوز را بشدت تخمیر نموده و مقدار زیادی اسید تولید می نماید، بر روی این محیط دارای جلای فلزی سبزرنگ می باشد .

کلبسیلا، انتروباکتر، سراشیا که تخمیرکنندگان ضعیف لاکتوز هستند بر روی محیط کلنی های ارغوانی تولید می نمایند .

پروتئوس، سالمونلا، شیگلا که قادر به تخمیر لاکتوز نیستند بر روی این محیط کلنی های شفاف ایجاد می‌کنند .


محیط مک کانکی (Mac conkey agar) :

مک کانکی آگار معمولترین محیط کشت انتخابی ـ افتراقی بوده ودارای رنگ کریستال ـ ویوله جهت ممانعت از رشد باکتریهای گرم ـ مثبت و اندیکاتور قرمز خنثی (Nautral red) جهت نشان دادن خصوصیات افتراقی می باشد . با سیل های گرم ـ منفی به‌آسانی بر روی این محیط رشدنموده و باکتریهای تخمیر کننده لاکتوز ، محصولات اسیدی تولید نموده که سبب کاهش PH در محیط اطراف کلنی می گردد . اندیکاتور قرمز خنثی در PH اسیدی قرمز رنگ می‌شود . پس میکروارگانسیم های لاکتوز ـ منفی بی رنگ و شفاف مشاهده می شوند . مک کانکی آگار محیط انتخابی و افتراقی مورد استفاده جهت گونه‌های شیگلا می باشد .

طرز تهیه محیط E.M.B و M.C مثل تهیه محیط نوترینت آگار می‌باشد .



محیط سالمونلا ـ شیگلا (s.s) :

در محیط S.s ترکیباتی مانند پپتون ، لاکتوز ، املاح صفراوی ، نوترال رد، آگار، بریلین گرین ، تیو سولفات سدیم وجود دارد . این محیط فقط اجازه رشد به باکتری های سالمونلا و شیگلا را می دهد . بریلین گرین موجود در محیط مانع رشد باکتریهای گرم ـ مثبت و دیگر گرم منفی ها در محیط S.s می شود . با استفاده از این محیط می‌توان سوشهای تخمیر کننده لاکتوز را از سوشهایی که توانایی تخمیر لاکتوز را ندارند، تشخیص داد .

سالمونلا ، شیگلا قادر به تخمیر لاکتوز نبوده، درمحیط S.s کلنی های بی رنگ ایجاد می کنند که ارزش تشخیصی دارد .

طرز تهیه :

برای ساخت این محیط مقدار مورد نیاز پودر S.s را در آب مقطر ریخته و به حجم می رسانید آنگاه بوسیله جوشاندن پودر را در آب مقطر کاملاً حل می‌کنید . این محیط احتیاج به اتوکلاو ندارد .



محیط مانیتول سالت آگار (Mannitol salt agar)

یک محیط انتخابی به منظور جداسازی استافیلوکوکهای بیماریزا ( کوآگولازمثبت) از نمونه هایی که حاوی باکتریهای متعدد هستند بکار می رود

غلظت زیاد نمک 5/7% موجود در این محیط مانع از رشد کوکسیهای غیر بیماریزا می شود . پس از کشت باید محیط را در 0C37 بمدت 36 ساعت انکوبه کرد . تخمیر قند مانیتول توسط باکتری مورد آزمایش ، بوسیله معرف فنل ـ رد موجود در محیط مشخص می‌گردد . پس از انقضای مدت انکوباسیون ، استافیلوکوک های غیر بیماریزا بر روی این محیط ، کلنی های کوچک و سفید تشکیل می دهند که با هاله ای ارغوانی یا قرمز احاطه می شوند . در حالیکه کلنی استافیلوکوکهای بیماریزا زرد رنگ بوده و هاله زرد رنگی نیز آنها را احاطه می کند .

طرز تهیه :

1- محیط را پس از حل کردن در آب مقطر به کمک حرارت مرطوب به مدت 15 دقیقه توسط اتوکلاو استریل نمایید .

2- پس از آنکه دمای محیط به 0c50-45 رسید ، آنرا در پلیت های استریل تقسیم نمائید .


محیط سلنیت F و تتراتیونات (Selenit f and Tetrathhionate media)

این محیط غنی برای رشد سالمونلا بکار می رود و به باکتریهای کلی فرم اجازه رشد داده نمی‌شود . مقدار زیادی از نمونه مدفوع را به 9 تا 10 میلی لیتر این محیط می‌افزایند که به صورت مایع است . پس از 24 ساعت انکوباسیون برای کشت دوباره محیطی مانند M.C و یا S.S آگار را بکار می برند .



محیط مولر هینتون (Muller-hinton.agar ) :

این محیط جهت انجام تست آنتی بیوگرام بکار می رود. این محیط همچنین قادر به فراهم آوردن شرایط رشد خانواده نایسریا نیز می باشد که در حالت اخیر ، باید محیط را پس از کشت نمونه مشکوک به نایسریا در فشار 10- 5 درصد CO2 انکوبه نمود .

طرز تهیه

1- مقدار مورد نیاز پودر مولر هینتون را دریک ارلن حاوی آب مقطر ریخته و به حجم مورد نظر برسانید .

2- با کمک حرارت ، پودر را در آب مقطر حل کنید تا محیط کاملاً شفاف شود .

3- پس از مسدود کردن درب ارلن، محتویات آن را توسط اتوکلاو استریل نمائید .

4- پس از آنکه حرارت محیط به 0C 50 ـ 40 رسید محیط را در شرایط استریل داخل پلیت ها تقسیم نمائید .



محیط تریپل شوگر آیرون ( TSI) :

این محیط بطور گسترده در تشخیص باکتریهای روده‌ای ( اعضای خانواده انتروباکتریاسه ) کاربرد دارد. که بصورت شیب دار در لوله آزمایش ساخته می شود و سطح بیشتری برای رشد باکتریها فراهم می‌آورد . کشت در محیط جامد بصورت عمقی ‌ـ‌ سطحی می‌گیرد .

محیط TSI حاوی معرف فنل ـ رد ، سولفات فرو ، تیو سولفات سدیم ( برای تشخیص تولید گاز سولفید هیدروژن ) و سه قند گلوگز ، لاکتوز و سوکروز است که غلظت گلوکز درمحیط 1/0 غلظت دو قند دیگر می باشد .

دامنه PH محیط از 8/6 تا 4/8 متغیر می باشد . این محیط قبل از کشت به دلیل داشتن معرف فنل ـ رد قرمز رنگ است .

با استفاده از TSI می توان سه خصوصیت را در یک باکتری مشخص نمود.

الف : توانایی تولید گاز CO2 , H2 از متابولیسم قندها .

ب : توانایی تولید مقادیر زیادی گاز سولفید هیدروژن که از طریق سیاه شدن محیط مشخص می شود .

( بی رنگ ) H2S تیوسولفات سدیم + محیط اسیدی ( باکتری )

(رسوب سیاه )FeS یون فریک + H2S

ج : توانایی تخمیر گلوکز ، لاکتوز و سوکروز .

باسیلهای گرم ـ منفی را بر اساس واکنش ایجاد شده بر روی این محیط می‌توان به پنج گروه تقسیم کرد :

در گروه I تخمیر گلوکز ، لاکتوز ، سوکروز ، منتهی به اسیدی شدن ( زرد شدن ) تمامی محیط و تولید گاز می‌گردد.

واکنش های ایجاد شده توسط باکتریهای گروه III,II همانند گروه I‌ است و تفاوت آنها فقط در تولید یا عدم تولید گاز است .

هنگامیکه عمق و سطح این محیط توسط باکتریهای گروه IV,III کشت داده می شود ، باکتری کشت داده شده ابتدا بطور هوازی و سپس بطریقه بی هوازی شروع به مصرف گلوکز می‌نماید . زمانی که هر دو طریقه در حال انجام است

( ساعات اولیه انکوباسیون ) PH‌ تمامی نقاط محیط کشت اسیدی و در نتیجه محیط زرد رنگ است اما از آنجایی که تخمیر هوازی در مقایسه با تخمیر بی هوازی با سرعت بیشتری بوقوع می‌پیوندد، گلوکز موجود در سطح به پایان رسیده و باکتریها شروع به تجزیه پپتون موجود در محیط می‌نمایند .از تجزیه پپتون در شرایط هوازی ، بی هوازی آمونیاک (NH3 ) تولید می‌شود . محصولات این عمل خاصیت قلیایی داشته و در نتیجه رنگ سطح محیط مجدداً قرمز می ‌شود . درهمین حال عمق محیط بدلیل سیر‌آرامتر تخمیر بی هوازی گلوکز، همچنان اسیدی و زرد رنگ باقی می‌ماند .

گروه V یا سیلهای گرم ـ منفی غیر تخمیر کننده مانند گونه های سودوموناس، پپتونهای موجود در محیط را تجزیه کرده ودر سطح و عمق محیط را بدون تولید گاز، قرمز رنگ می‌نمایند